在皮膚科外用制劑與護膚品的研發(fā)進程中，藥物經(jīng)皮滲透數(shù)據(jù)的準確性至關(guān)重要，它直接關(guān)系到產(chǎn)品的藥效與安全性評估。為獲得更接近實際使用情況的數(shù)據(jù)，使用人體皮膚進行試驗更為理想。然而，在實際研究中，新鮮人體皮膚的獲取往往面臨諸多困難，冷凍保存成為皮膚樣本儲存的常規(guī)操作。但冷凍-解凍過程是否會影響皮膚的屏障功能與藥物滲透特性，一直是行業(yè)內(nèi)爭論的焦點。

近期來自北里大學的Miki Wada研究團隊發(fā)表于《Journal of Society of Cosmetic Chemists of Japan》的一項研究為這一爭議提供了新的證據(jù)。來自北里大學和 Mandom 公司的研究團隊以手術(shù)切除后同一供體的新鮮眼瞼皮膚為研究對象，系統(tǒng)比較了冷凍保存與未冷凍皮膚在藥物滲透性、皮膚結(jié)構(gòu)及酶活性等方面的差異，為外用制劑研發(fā)中的皮膚樣本選擇提供了重要參考。

研究背景：皮膚保存的爭議與必要性

皮膚作為人體最大的器官，其最外層的角質(zhì)層是藥物經(jīng)皮滲透的主要屏障。角質(zhì)層的細胞間脂質(zhì)排列結(jié)構(gòu)、完整性直接影響藥物的滲透效率。在體外滲透試驗中，皮膚樣本的質(zhì)量與保存條件是決定實驗數(shù)據(jù)可靠性的關(guān)鍵因素。

目前，OECD 指南雖對皮膚吸收試驗方法有明確規(guī)定，但未對皮膚保存條件作出詳細說明?，F(xiàn)實中，由于新鮮人體皮膚供應(yīng)不穩(wěn)定且難以即時使用，研究者普遍采用冷凍保存（通常 - 80℃）的方式延長皮膚樣本的使用期限。然而，既往研究因動物種屬、冷凍溫度、保存時長等變量差異，得出的結(jié)論存在顯著分歧：部分研究認為冷凍會破壞皮膚結(jié)構(gòu)導致滲透性增加，另一些研究則表明短期冷凍對皮膚屏障功能無顯著影響。

這種爭議給外用制劑研發(fā)帶來了困擾：使用低溫冷凍保存的皮膚獲得的滲透數(shù)據(jù)是否能真實反映新鮮皮膚的生理狀態(tài)？不同保存條件下的實驗結(jié)果是否具有可比性？為解決這些問題，本研究采用同一來源供體的眼瞼皮膚，在嚴格控制變量的前提下，開展了冷凍與未冷凍皮膚的對比研究。

實驗設(shè)計

皮膚部位樣本選擇

研究團隊選擇了面部（眼瞼）皮膚作為研究對象，試驗所用皮膚為北里大學醫(yī)院整形外科提供的手術(shù)剩余皮膚。本研究經(jīng)北里大學內(nèi)部倫理委員會審查批準，并在獲得受試者知情同意后實施。這個皮膚部位的選擇具有重要的實際意義。與常用的腹部皮膚或動物皮膚相比，眼瞼皮膚更接近外用藥物與化妝品的實際應(yīng)用部位，且角質(zhì)層較薄、屏障功能特性獨特，實驗結(jié)果更具參考價值。

保存條件的對比

實驗設(shè)置了兩組對比樣本：

• 未冷凍組：皮膚樣本在 5℃條件下用 PBS 濕潤的紗布保存，保存時長 1 - 4 天；

• 冷凍組：皮膚樣本經(jīng)橄欖油包裹后置于- 80℃冷凍保存，保存時長 1 - 4 天，使用前解凍。

這種設(shè)計排除了供體個體差異、保存時長等干擾因素，聚焦于冷凍 - 解凍過程本身對皮膚的影響。

模型藥物的代表性

研究選用兩種理化性質(zhì)差異顯著的藥物作為對象：

• 水溶性藥物：咖啡堿（CAF，CAS No. 58-08-2，MW＝194.2，logP＝－0.1），常用于經(jīng)皮滲透研究的模型化合物；

• 油溶性藥物：異丙基酚（IPMP，CAS No.3228-02-2, MW=150.2,logP=3.37），廣泛應(yīng)用于外用制劑抗菌類化合物。

通過兩種藥物的對比，可全面評估皮膚保存條件對不同極性藥物滲透的影響。

6項實驗分析對比

為深入探究冷凍對皮膚的影響機制，研究設(shè)置了6個維度的檢測指標：

1. 藥物滲透量：采用 Franz 擴散池法，測定 1 - 24 小時內(nèi)兩種藥物的累積透皮量；

2. 皮膚內(nèi)藥物殘留：通過分層取樣，分析滲透 24 小時后表皮、真皮中的藥物殘留濃度；

3. 角質(zhì)層藥物分布：采用AST-01皮膚剝離膠帶（ASCH Japan）結(jié)合 HPLC 檢測，評估咖啡堿在角質(zhì)層不同深度的分布；通過Labodorf 850C皮膚角質(zhì)量測試儀對每個樣品的角質(zhì)進行定量，更準確反映模式藥物在角質(zhì)層中的相對含量，消除不同皮膚樣本角質(zhì)層總量差異對實驗結(jié)果的干擾。

（Labodorf 850C皮膚角質(zhì)量測試儀）

4. 屏障功能評估：通過VAPOSCAN AS-VT100經(jīng)皮水分流失測量儀（ASCH Japan）測試反映皮膚整體屏障功能。

VAPOSCAN AS-VT100經(jīng)皮水分流失測量儀（ASCH Japan）

5. 脂質(zhì)結(jié)構(gòu)分析：利用共聚焦 Raman光譜技術(shù)，解析角質(zhì)層細胞間脂質(zhì)的排列有序性；

6. 酶活性檢測：測定酯酶活性，評估皮膚生化功能的完整性。

實驗發(fā)現(xiàn)：冷凍顯著改變皮膚滲透特性

冷凍皮膚的藥物滲透性顯著提高

實驗結(jié)果顯示，兩種藥物在冷凍皮膚中的累積滲透量均顯著高于未冷凍皮膚。對于咖啡堿，在 4、6、8 小時三個時間點，冷凍皮膚的滲透量顯著更高；對于異丙基酚，這一差異在 6、8、24 小時更為明顯。這一結(jié)果表明，冷凍 - 解凍過程會導致皮膚對水溶性和油溶性藥物的滲透性普遍增強，且這種增強效應(yīng)隨時間推移更加顯著。

這一發(fā)現(xiàn)對制劑研發(fā)具有參考意義：若采用冷凍皮膚進行滲透試驗，可能會高估藥物的實際滲透效率，尤其是對于需要長期評估的制劑。

隨時間推移，冷凍及新鮮皮膚中 CAF 和 IPMP 的累積量。所示數(shù)值為 11 - 14 個皮膚樣本的平均值（●：冷凍皮膚，○：新鮮皮膚，*t 檢驗：p < 0.05）。

藥物在皮膚內(nèi)的分布存在差異

滲透試驗 24 小時后，皮膚各層的藥物殘留分析揭示了更細微的差異：

• 表皮中，未冷凍皮膚的咖啡堿殘留量顯著高于冷凍皮膚，而異丙基酚的殘留量無顯著差異；

• 真皮中，兩種藥物在兩組皮膚中的殘留量均無顯著差異。

滲透測試24小時后，表皮/真皮中CAF/IPMP的殘留量。CAF/IPMP的量通過皮膚重量進行了歸一化處理。所示數(shù)值為6 - 8個皮膚樣本的平均值。t檢驗：p < 0.05。

進一步的角質(zhì)層分層研究顯示，未冷凍皮膚的角質(zhì)層各深度（1-5 層至16-20 層）咖啡堿殘留量均高于冷凍皮膚。且未冷凍皮膚的咖啡堿殘留量隨角質(zhì)層深度增加而逐漸降低，符合正常的藥物滲透梯度；而冷凍皮膚的咖啡堿殘留量在各深度分布較為均勻，提示角質(zhì)層的屏障梯度可能已被破壞。

6小時滲透測試后角質(zhì)層中CAF的殘留量。該數(shù)值顯示了五個剝離膠帶總和的CAF含量。CAF含量通過角質(zhì)層蛋白量進行了歸一化處理。展示了兩個皮膚樣本的平均值。

這些結(jié)果表明，冷凍可能通過改變角質(zhì)層的藥物滯留能力，影響藥物的經(jīng)皮轉(zhuǎn)運過程。水溶性藥物受冷凍影響更為明顯，可能與角質(zhì)層脂質(zhì)結(jié)構(gòu)對水溶性物質(zhì)的阻滯作用更易受物理損傷有關(guān)。

角質(zhì)層脂質(zhì)結(jié)構(gòu)紊亂對藥物滲透的影響

共聚焦 Raman 光譜分析為冷凍影響皮膚屏障功能提供了直接證據(jù)。角質(zhì)層細胞間脂質(zhì)的有序性可通過特征峰強度比I₁₀₈₀/(I₁₀₆₀+I₁₁₃₀)評估，該比值越低，脂質(zhì)排列越有序。

結(jié)果顯示，在角質(zhì)層表面（0 - 2μm），兩組皮膚的脂質(zhì)有序性無顯著差異；但在中深層（4 - 16μm），冷凍皮膚的特征峰比值顯著高于未冷凍皮膚，表明其脂質(zhì)結(jié)構(gòu)有序性降低、出現(xiàn)明顯紊亂。這種結(jié)構(gòu)破壞可能是導致藥物滲透性增加的原因：脂質(zhì)排列紊亂使藥物更容易通過細胞間隙擴散。

利用峰強度比I₁₀₈₀/(I₁₀₆₀+I₁₁₃₀)通過拉曼散射測定的角質(zhì)層細胞間脂質(zhì)結(jié)構(gòu)的深度分布。所示數(shù)值為6-8個測定點的平均值（●：冷凍皮膚，○：新鮮皮膚，t檢驗：p < 0.05）。

值得注意的是，經(jīng)皮水分流失量（TEWL）測定未發(fā)現(xiàn)兩組皮膚的顯著差異。這提示 TEWL 作為整體屏障功能的評估指標，可能無法靈敏捕捉角質(zhì)層局部結(jié)構(gòu)的細微變化，而 Raman 光譜等微觀結(jié)構(gòu)分析技術(shù)更具優(yōu)勢。

酯酶活性不受冷凍影響

皮膚中的酯酶活性是評估皮膚生化功能的重要指標，與藥物的代謝轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。實驗結(jié)果顯示，冷凍與未冷凍皮膚的酯酶活性無顯著差異，表明冷凍 - 解凍過程未對皮膚的酶促反應(yīng)能力未造成明顯影響。

這一發(fā)現(xiàn)具有積極意義：對于需要考慮皮膚代謝因素的滲透研究，冷凍皮膚可在一定程度上保留酶活性，其代謝相關(guān)數(shù)據(jù)仍具有參考價值。

研究啟示：對制劑研發(fā)的實用指導

實驗設(shè)計需統(tǒng)一皮膚保存條件

本研究明確證實，皮膚保存條件會顯著影響藥物滲透數(shù)據(jù)。因此，在外用制劑研發(fā)的體外滲透試驗中，應(yīng)嚴格統(tǒng)一皮膚樣本的保存條件：

• 若需比較不同配方的滲透效率，所有實驗必須使用相同保存狀態(tài)（均冷凍或均未冷凍）的皮膚；

• 研究報告中應(yīng)詳細注明皮膚的來源、保存溫度、保存時長及解凍方法，確保實驗結(jié)果的可重復性與可比性。

不同類型藥物需差異化評估

研究顯示，水溶性藥物與油溶性藥物受冷凍的影響程度存在差異。在實際研發(fā)中：

• 對于水溶性成分占主導的制劑（如保濕類護膚品、水溶性抗生素軟膏），需特別關(guān)注冷凍對滲透數(shù)據(jù)的高估風險；

• 對于油溶性成分制劑，雖冷凍影響相對較小，但仍需謹慎解讀實驗結(jié)果，必要時結(jié)合新鮮皮膚數(shù)據(jù)進行驗證。

優(yōu)化皮膚保存與實驗方法

基于研究結(jié)果，可對現(xiàn)有皮膚處理方法進行優(yōu)化：

• 短期保存（1 - 4 天）可優(yōu)先選擇 5℃冷藏而非冷凍，以更好地保留皮膚的天然屏障特性；

• 若必須冷凍保存，建議采用橄欖油等保護劑減少冰晶形成對脂質(zhì)結(jié)構(gòu)的損傷；

• 在滲透試驗中引入 Raman 光譜等結(jié)構(gòu)分析技術(shù)，結(jié)合傳統(tǒng)滲透數(shù)據(jù)，更全面評估皮膚樣本質(zhì)量。

推動行業(yè)標準的完善

目前 OECD 等指南對皮膚保存條件的模糊規(guī)定是導致實驗結(jié)果差異的重要原因。本研究結(jié)果支持在相關(guān)指南中加入更明確的皮膚保存規(guī)范，如推薦保存溫度、最長保存時長、質(zhì)量驗證方法等，促進行業(yè)研究數(shù)據(jù)的標準化與可比性。

研究局限與未來方向

盡管本研究設(shè)計嚴謹，但仍存在一定局限性：樣本量較小且僅使用眼瞼皮膚，不同部位（如腹部、背部）皮膚的冷凍響應(yīng)可能存在差異；保存時長限定在 1 - 4 天，長期冷凍（如數(shù)月）的影響尚未評估；未深入探究冷凍導致脂質(zhì)結(jié)構(gòu)紊亂的分子機制。

未來研究可從以下方向展開：

• 擴大樣本來源，比較不同部位皮膚對冷凍的響應(yīng)差異；

• 延長觀察周期，研究長期冷凍對皮膚結(jié)構(gòu)與功能的影響；

• 結(jié)合小角 X 射線散射等技術(shù)，更精細地解析冷凍對脂質(zhì)層狀結(jié)構(gòu)的影響；

• 探索優(yōu)化的冷凍保護劑配方，減少冷凍對皮膚屏障功能的損傷。

結(jié)語

皮膚保存條件對藥物滲透性的影響長期以來存在爭議，本研究通過一系列實驗發(fā)現(xiàn)冷凍 - 解凍過程會通過破壞角質(zhì)層細胞間脂質(zhì)的有序結(jié)構(gòu)，增加皮膚對水溶性和油溶性藥物的滲透性，且對藥物在皮膚內(nèi)的分布產(chǎn)生顯著影響。

這些發(fā)現(xiàn)對外用制劑研發(fā)具有指導價值，提醒研究者在實驗設(shè)計中充分考慮皮膚保存條件的影響，通過標準化操作與檢測技術(shù)的結(jié)合，提高滲透數(shù)據(jù)的可靠性。隨著研究的深入與行業(yè)標準的完善，未來的外用制劑研發(fā)將更加精準、高效，為患者提供更安全有效的產(chǎn)品。

參考文獻

1）A. M. Barbero, H. F. Frasch, Skin Pharmacol. Physiol., 29,31─40（2016）

2）J. B. Nielsen, I. Plasencia, J. A. Sørensen, L. A. Bagatolli,Skin Pharmacol. Physiol., 24, 93─102（2011）

3）B. Finnin, K. A. Walters, T. J. Franz, Topical and Transdermal Drug Delivery: Principles and Practice, Chapter 5, John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, 2011, p. 85─108

4）Miki Wada, Kazuhiro Shiga, Toshihiro Mori, Katsunori Yoshida, The Effect of Skin Storage Conditions on Drug Permeability, Journal of Society of Cosmetic Chemists of Japan, 2025, Volume 59, Issue 2, Pages 81-87