實(shí)驗(yàn)研究 | 上樣量多少對睪酮軟膏體外透皮試驗(yàn)的經(jīng)皮吸收數(shù)據(jù)影響

引言：

韓國檀國大學(xué)Jueng-Eun Im、Kyu-Bong Kim團(tuán)隊(duì)聯(lián)合韓國食品藥品安全評估院等機(jī)構(gòu)，在《Pharmaceutics》（2021年，Vol.13, IF=6.525）發(fā)表研究，通過Biox AquaFlux™ AF200和Hanson Franz擴(kuò)散池系統(tǒng)，明確了應(yīng)用量對睪酮體外皮膚吸收的影響，提出了風(fēng)險(xiǎn)評估所需的應(yīng)用劑量。

摘要：

化學(xué)品的皮膚吸收是風(fēng)險(xiǎn)評估的重要因素。本研究探討了不同應(yīng)用量對皮膚吸收的影響，并提出了適宜的應(yīng)用劑量以實(shí)現(xiàn)可靠的皮膚吸收。選用cafe和睪酮作為測試化合物，采用Franz擴(kuò)散池進(jìn)行體外皮膚吸收試驗(yàn)。將含1%cafe和0.1%睪酮的半固體（乳膏）和液體（溶液）制劑，以不同用量（5、10、25、50毫克或微升/平方厘米）分別應(yīng)用于大鼠和微型豬（Micropig®）皮膚。

24小時(shí)后，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）或高效液相色譜（HPLC），測定皮膚表面、角質(zhì)層、真皮與表皮及受體液中兩種化合物的濃度。結(jié)果顯示，在大鼠和微型豬兩種皮膚類型，以及乳膏和溶液兩種制劑中，兩種化合物的皮膚吸收率均隨應(yīng)用量增加而下降。尤其在50毫克（或微升）/平方厘米用量下，兩種化合物在大鼠和微型豬皮膚中的吸收率，均顯著低于5或10毫克（或微升）/平方厘米用量組。因此，為獲得保守的皮膚吸收數(shù)據(jù)，應(yīng)采用低劑量（5或10毫克/微升/平方厘米）的制劑進(jìn)行應(yīng)用。

體外Franz擴(kuò)散池設(shè)備：

所有大鼠和微型豬（Micropig®）皮膚膜均以真皮面朝下的方式，安裝在Franz擴(kuò)散池中。該設(shè)備配置Vision Microette自動進(jìn)樣器、循環(huán)水浴鍋、攪拌板、攪拌控制器及自動補(bǔ)液功能（美國加利福尼亞州查茨沃思市漢森公司）。受體液（RF）室體積為12毫升，水浴鍋溫度設(shè)定為32.5℃，通過水循環(huán)維持受體液恒溫。受體室中分別裝入pH 7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS）和含6%（體積分?jǐn)?shù)）聚乙二醇（PEG）的PBS，分別作為睪酮測試的受體液。

皮膚膜解凍至室溫后安裝到Franz擴(kuò)散池上，并用生理鹽水水合。使用前，采用英國Biox AquaFlux經(jīng)皮水分流失測量儀評估皮膚膜完整性。暴露1.77平方厘米的皮膚區(qū)域，分別將含1%cafe或0.1%睪酮的乳膏或液體制劑，按5、10、25、50毫克/平方厘米或5、10、25、50微升/平方厘米的用量涂抹于暴露區(qū)域。涂抹時(shí)，通過無菌注射器向供給室注入約8.85、17.7、44.25和88.5毫克（或微升）的制劑，以保證實(shí)驗(yàn)條件適宜。僅將擴(kuò)散池標(biāo)準(zhǔn)頂部組件固定在皮膚膜上，減少采樣過程中的反向擴(kuò)散。

（Biox AquaFlux經(jīng)皮水分流失測量儀）

隨后，用新鮮受體液沖洗自動進(jìn)樣器后，采集200微升受體液樣品，采樣時(shí)間設(shè)定在涂抹后0、1、2、4、8、12和24小時(shí)。用BD™酒精棉片將殘留制劑沖洗三次，棉片收集于提取溶劑中（cafe用40毫升50%（體積分?jǐn)?shù)）甲醇，睪酮用20毫升甲醇），全程為每個(gè)測試收集沖洗樣品（WASH）。用思高膠帶剝離皮膚表面15次，獲取角質(zhì)層（SC）上的殘留制劑樣品。將使用過的皮膚膜用手術(shù)剪剪成8塊，置于適宜溶劑中提?。╟afe用20毫升50%（體積分?jǐn)?shù)）甲醇，睪酮用10毫升甲醇），得到皮膚樣品（SKIN）?？偽章拾雌つw樣品和受體液樣品中測得的睪酮總量，與涂抹的睪酮總用量的比值計(jì)算。

結(jié)論：

總之，為獲取用于暴露風(fēng)險(xiǎn)評估的保守皮膚吸收數(shù)據(jù)，建議乳膏制劑采用5或10毫克/平方厘米的劑量，液體制劑采用5或10微升/平方厘米的劑量。該劑量范圍與現(xiàn)有法規(guī)中的劑量要求相近或更為寬松。根據(jù)韓國化妝品人體表面積使用統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，該建議劑量范圍也處于韓國各類化妝品每表面積每日用量（0.005714–18.75毫克/平方厘米）及歐洲同類用量（0.01086–15.63毫克/平方厘米）之內(nèi)，因此所選應(yīng)用條件具有實(shí)際可行性。

本研究采用Franz擴(kuò)散池進(jìn)行皮膚吸收測試，該方法可作為動物替代測試方法應(yīng)用于化妝品研究。所用微型豬（Micropig®）剩余皮膚作為實(shí)驗(yàn)供體，相較于大鼠皮膚體外測試方法，在動物倫理方面更具優(yōu)勢。

本研究結(jié)果有望適用于其他藥物，即其他藥物可能呈現(xiàn)相似趨勢。通常，皮膚吸收率以“滲透量"占“應(yīng)用量"的百分比計(jì)算，且已知化學(xué)物質(zhì)在無限劑量條件下的滲透量會趨于恒定。

因此，若對其他藥物采用足夠高的應(yīng)用量（即無限劑量）進(jìn)行皮膚吸收測試，其滲透量將保持恒定，僅應(yīng)用量增加，皮膚吸收率預(yù)計(jì)會下降。Frasch等人也提出，化學(xué)物質(zhì)的應(yīng)用負(fù)荷對皮膚吸收率影響顯著。

本研究有望為化妝品、藥品及各類化學(xué)物質(zhì)的監(jiān)管提供參考。但本研究存在局限性：僅使用了兩種測試物質(zhì)。若能采用具有不同辛醇-水分配系數(shù)（LogKow）值的測試物質(zhì)進(jìn)行多組結(jié)果對比，或?qū)⒀芯恐貜?fù)次數(shù)增加，將有助于減少數(shù)據(jù)離散度、提高數(shù)據(jù)一致性。

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【3】Lehman, P.A., Raney, S.G., Franz, T.J. Percutaneous absorptionin man: In vitro-in vivo correlation. Skin Pharmacol. Physiol., 2011,24(5), 224-230.